今天，我们非常有幸邀请到丹麦Ferring Pharmaceuticals担任首席科学家杨翼博士在“肽研社”公众号平台进行分享。
杨翼博士
德国比勒菲尔德大学博士
Ferring Pharmaceuticals
首席科学家
杨翼博士于2008年在德国比勒菲尔德大学获得博士学位，并于同年加入位于瑞士 Visp的LONZA AG，从事多肽原料药的工艺开发与GMP生产。杨翼博士如今在丹麦Ferring Pharmaceuticals担任首席科学家，负责公司多肽药物的项目管理、工艺研发、优化、验证、GMP生产监督，以及Lean Six Sigma项目。
杨翼博士拥有丰富的多肽工业生产经验，在多肽药物合成路线设计、QbD指导的生产工艺开发、优化和验证、多肽副反应与杂质研究，PGI （潜在基因毒性杂质） 管理、多肽药物GMP生产与项目管理，多肽化学创新等领域有颇多建树，多次在国际会议上做关于多肽化学与多肽GMP生产的学术报告。杨翼博士拥有Lean Six Sigma黑带认证。
杨翼博士撰写，由Elsevier出版社出版的Side Reactions in Peptide Synthesis（多肽合成副反应）一书是多肽化学领域第一本系统性论述多肽合成副反应的专著，广受行业赞誉。目前杨翼博士正在准备另一本关于多肽化学不稳定性和降解的学术专著，有望成为多肽药物分子设计、多肽化学生产以及多肽药物制剂领域的指导。
前 言
自从2018年缬沙坦类药物因二甲基亚硝胺杂质超标被召回后，亚硝胺这个潜在致癌物再次成为制药业头顶上的达摩克利斯之剑，威胁着药品的质量与患者的安全。
亚硝胺指的是包含R1R2N－N＝O结构的化合物，其中R1， R2通常为烷基。亚硝胺的遗传毒性和致癌潜力早在50多年前便浮出水面。2020 年 9 月，FDA 发布了制药行业关于控制药品中亚硝胺杂质的指南。FDA 数据库显示，由于存在一定水平的可能致癌物亚硝胺杂质（超过 26．5 ng／天的可接受摄入量限制），在过去的两年内已从市场召回超过 1400 批产品。召回产品中存在的药物包括缬沙坦、厄贝沙坦、氯沙坦、二甲双胍、雷尼替丁和尼扎替丁 （图1）。
图1．部分因亚硝胺杂质被召回的药物化学结构式
何亚硝胺的遗传毒性和致癌性
亚硝胺类化合物属于“关注类”高诱变致癌物，该类物质已被世卫组织国际癌症研究机构IARC归入可能是人类致癌物类别。大多数亚硝胺对于非人类动物都是致癌物。
美国药品研究与制造商协会 （PhRMA） 根据化合物与DNA反应的活性，将所研究的化合物分为三类，即I类、II类和III类。含有 N－羟基、N－酰基的芳香胺类化合物和 N－氧化物的芳香胺属于 I 类。II 类物质包括醛、羟烷基胺、N－亚硝胺，硝基化合物、氮丙啶、环氧化物、丙内酯、丙磺内酯、氨基甲酸酯、肼和偶氮化合物。III类物质包括迈克尔加成反应的受体、膦酸酯、磺酸酯、卤代烷、卤代烯烃和烷基／芳基卤化物 （图2）。在该分类中，亚硝胺被分在II类，说明其具备相当的DNA的反应活性。
图2． 根据与DNA反应活性的化合物分类。
（图片来源：Journal of Medicinal Chemistry）
根据国际癌症研究机构对各种致癌物致癌性的研究，他们将亚硝胺物质按照人类致癌性标准分为四组。第 1 类亚硝胺具有“对人类致癌”的充分证据 （NNN 与 NNK）。2A 类亚硝胺“可能 （probably） 对人类致癌”，因其针对人类致癌性的数据有限，但在实验动物身上有足够的证据。2B 类亚硝胺“或许（possibly）对人类致癌”，在人类和实验动物中获取的证据都比较有限。剩下的数据不足的亚硝胺化合物，则被归为第3类“不能归类为人类致癌性的物质” （图3）。
图3． 国际癌症研究机构的亚硝胺致癌性分类。
（图片来源：Journal of Medicinal Chemistry）
如同亚硝酸盐一样，亚硝胺本身并不直接导致诱变性和致癌性。如图4所示，摄入体内的亚硝胺类物质1，在细胞色素P450（cytochrome P450）的作用下被氧化为α－羟基亚硝胺 2 （此过程需要亚硝胺底物含有Hα，没有Hα的取代亚硝胺不发生这个羟基化过程，因此可能不具诱变性及致癌性）。后者通常不稳定，消除一个醛分子并转化为1－羟基－2－烷基二亚胺3。化合物3经过脱水产生烷基重氮盐（diazonium）4，这个不稳定的重氮盐在释放一分子氮气后转化为高活性的碳正离子5。在这个过程中形成的碳正离子，可以说是亚硝胺化合物遗传毒性和致癌性的直接凶手。由于高度的亲电性（NDMA形成的碳正离子为甲基正离子，具有比其它烷基正离子更高的活性），碳正离子5 作为一个高效的烷基化试剂进攻蛋白质和DNA上的众多亲核基团，产生烷基化的结果。DNA中电子富集的碱基具有高亲核性，因此成为了高亲电碳正离子主要的进攻目标。例如，碳正离子可以亲电进攻鸟嘌呤Guanine的N7位置（N7G），使之成为烷基化鸟嘌呤，同样可以进攻鸟嘌呤的O6 （O6G）和胸腺嘧啶Thymine的O4（O4T）。这些碱基在遭受了烷基化改性之后，形成了稳定的烷基化碱基，从而导致了可能的诱变性和致癌性。除此之外，在亚硝胺生物转化过程种产生的醛，也可能带来遗传毒性或致癌性。比如NDMA释放的甲醛，被世卫组织和美国卫生与公共服务部认定为“人类致癌物”。作为一种已知的交联剂，甲醛可以通过亚甲基桥介导碱基对之间的交联反应，从而激发潜在的致癌性。因此，NDMA和其它亚硝胺也因为其诱导的DNA兼济烷基化和醛生成， 而被视为“双重致癌物”。1，2
强效亚硝胺如 NDMA 和 NDEA 的DNA 损伤特异性仍不清楚，但已确定它们会产生促诱变 O6－烷基鸟嘌呤加合物（即通过添加小烷基如 －CH3 对鸟嘌呤进行修饰），由此诱发的烷基化鸟嘌呤最常通过 DNA 烷基转移酶 （AGT，也称为甲基－鸟嘌呤－甲基－转移酶，MGMT） 进行脱烷基化修复。其他亚硝胺如 NDBA、NDELA、NMEA、NNK 和 NNN 也已知会产生 O6－烷基鸟嘌呤加合物。MGMT酶的活性在人体内具有高度差异。一项小型研究表明，人类结肠黏膜中 MGMT 的活性变差为 6 至 7 倍。在啮齿动物细胞系（例如大鼠肝脏）中，与人类细胞系相比，MGMT 修复酶是可诱导的。这可能表明大鼠和人类之间在解毒方面的潜在差异，因此以动物模型推算亚硝胺对人的致癌性可能是不准确的。
图4． 亚硝胺生物体内转化为碳正离子，以及碳正离子修饰DNA的生化过程。
亚硝胺杂质产生的根源分析
沙坦类药物在化学结构上最显著的共同点在于四唑环。在沙坦类药物的合成中，四唑的环化是由有机腈与叠氮化钠的环加成反应在高沸点溶剂（如二甲基甲酰胺或者N－甲基吡咯烷酮）中实现的，反应结束后，过量的叠氮化钠用亚硝酸钠淬灭。然而在这个特过程中使用的二甲基甲酰胺和N－甲基吡咯烷酮中分别含有二甲胺和4－甲氨基丁酸杂质（这些杂质即可能是这些溶剂的合成原料，也可能是溶剂分子降解的产物）。这些仲胺在叠氮化钠的淬灭反应中与淬灭剂亚硝酸钠作用，产生了相应的亚硝胺NDMA （二甲基亚硝胺） 和NMBA （N－亚硝基－N－甲基－4－氨基丁酸）。这个过程是沙坦类药物产生亚硝胺杂质的根本原因（图5）。尤其是考虑到叠氮化钠淬灭可能是整个沙坦合成工艺的最后一步，产生的亚硝胺杂质污染最终产品的可能性大大增加。吡格列酮案例中二甲基亚硝胺（NDMA）形成的机理类似于沙坦，不同的是， 亚硝酸钠与而二甲基甲酰胺并不出现在同一步反应中，而是上一步的亚硝酸钠被部分携带到二甲基甲酰胺的步骤，从而与二甲胺杂质反应，形成了亚硝胺杂质。
图5． 四唑环化，叠氮化钠淬灭，以及DMF／NMP介导的亚硝胺形成反应。
综合来看，在药物生产（包括原料药与成品药）中产生亚硝胺杂质的可能来源包括，但不限于以下几个方面：
· 在同一步或者不同步的工艺步骤（例如发生残留物转移）中，在存在仲胺或叔胺或季铵盐的情况下使用亚硝酸钠。
· 在同一步或者不同步的工艺步骤，将亚硝酸钠与易降解为仲胺或叔胺的试剂、溶剂和催化剂结合使用（例如二甲基甲酰胺和N－甲基吡咯烷酮中的二甲胺和4－甲氨基丁酸杂质／降解物）。
· 在活性药物成分 （API） 制造过程中使用受污染的原材料。
· 回收材料（例如溶剂）的使用。包括外包第三方的回收原料，而操作方并不清楚待回收原料中的杂质组成成分。以及在非专用设备中进行的常规回收过程。
· 使用由供应商提供的受污染的原材料和中间体，这些供应商使用的工艺或原材料可能会形成亚硝胺。而制造商并不清楚这些原材料和中间体的详细杂质构成。
· 由于在同一条生产线上运行的不同工艺以及与操作员相关的错误导致的交叉污染事件。
· 起始材料、中间体和原料药的降解过程，包括由固有反应性和亚硝酸钠残留引起的降解过程（可能在成品要生产过程或储存期间发生）。
· 使用某些包装材料。
多肽类药物与亚硝胺杂质的相关性
目前尚未有多肽类药物因为亚硝胺杂质超标而引发的药物召回事件。但2018年的沙坦类药物召回事件，已经促使包括FDA和EMA在内的众多药监机构加大了亚硝胺杂质形成的风险评估要求。包括多肽类药物制造商和CMO都已经接受到了各自药监部门的要求，对其生产工艺形成亚硝胺杂质的可能性做出彻底详尽的调查分析。
常规的多肽类药物固相合成的工艺中并不过多涉及亚硝酸盐或者亚硝酸酯类的原料。某些使用酰基叠氮法液相合成多肽，或者进行多肽片段缩合的工艺会使用亚硝酸盐，将酰肼前体 （通常由酯经过肼解反应制备） ，经过氧化亚硝酸化过程转化为酰基叠氮化合物，并与对应的氨基化合物进行缩合，完成目标酰胺键的构造（图6）。3
图6． 酰基叠氮法合成多肽的化学反应。
酰基叠氮曾经是多肽合成最初期常用的缩合方法，尽管这种工艺存在反应速率慢的内在问题，但由于酰基叠氮在与氨基缩合过程中很低的消旋化副反应，因此仍然作为一种有效的手段介导易于遭受消旋化的多肽片段缩合反应。由于历史原因，很多早期获批上市的多肽药物是通过液相合成的方式生产的，因此至今仍在沿用看上去已经有些过时的酰基叠氮法液相片段缩合工艺。在该工艺中，N－端的片段在通常在液相中制备，因此其C端基团通常为酯 （通常是甲酯） 保护基团（以避免液相反应中的副反应）。在液相合成片段完毕后，利用肼将多肽片段的酯基团转换为相应的酰肼，后者再被亚硝酸盐氧化，得到亚硝基酰肼中间体，并脱水得到酰基叠氮多肽。这个含有酰基叠氮结构的N端多肽片段，在接下来的液相片段缩合反应中，与C－端片段的Nα进行缩合反应，制备完整肽链（图7）。
由于在这个过程中使用了亚硝酸钠作为反应试剂，因此产生亚硝胺杂质的风险极大。因此，对于含有此类反应的多肽合成工艺，需要对其进行彻底的风险评估，必要的时候应该使用已验证的分析手段，对于中间品，粗品，或者纯品进行亚硝胺的检测。除此之外，也要对亚硝酸盐进行同样的风险评估，因为亚硝酸盐如果被携带到了最终的产品，那么将有可能在接下来的制剂步骤，甚至产品储存阶段，与药物分子或者赋形剂，亦或产品中杂质的仲胺进行反应，生成亚硝胺杂质。我在审阅制造商的风险评估报告中，就发现了他们只对亚硝胺的生成、携带和清除做了分析评估，却完全忽略了亚硝酸钠的数据，这是一个巨大的漏洞。
图7． 酯－酰肼－亚硝基酰肼－酰基叠氮转化过程介导的多肽液相缩合反应
多肽化学中另一个可能与亚硝胺杂质牵扯上的物质是缩合试剂添加剂oxyma。由于它更好的热稳定性与不易爆炸的特点，oxyma在工业领域已经逐渐取代了传统的HOBt，成为了默认的多肽缩合试剂添加剂，与DIC共同使用介导常规的氨基酸缩合反应。Oxyma的生产工艺中可能使用亚硝酸作为反应物（图8）。对于那些在上游合成的最后一步为液相反应，且使用oxyma作为原料的案例来说，需要注意可能携带的亚硝酸（盐）。通常的oxyma的Certifate of Analysis（CoA）中并不包含亚硝酸或者亚硝酸盐杂质的含量，但随着监管部门对于药物亚硝胺控制趋于严格，多肽药物制造商应该获取oxyma的生产工艺以及包含亚硝酸（盐）的CoA。
图8． Oxyma合成路线
整体看来，常规的多肽合成，尤其是固相多肽合成，形成亚硝胺杂质的可能性极低，因为在反应中并不涉及亚硝化反应物。即便产生了痕量亚硝胺或者亚硝酸盐，也会在液相色谱纯化的步骤被清除。需要注意的是那些使用酰肼制备酰基叠氮的多肽药物生产工艺，不仅要检测亚硝胺的形成与清除，也要监控亚硝酸盐在这个过程中的转化，清除与残留。
亚硝胺杂质在多肽药物合成的另一来源是有机溶剂。多肽合成的常规有机溶剂DMF与NMP中可能含有不同含量的二级胺杂质，也是NDMA与NMBA亚硝胺产生的前体，它们在亚硝化试剂的存在下可能产生亚硝胺杂质，这也是沙坦类药物亚硝胺污染事件的根源。除此之外，使用来源不明的再利用有机溶剂，其中可能会含有亚硝胺或者亚硝酸盐类物质，也会对多肽药物合成造成潜在的威胁。
多肽药物亚硝胺杂质应对策略
美国药典公约 （USP） 于 2022 年 2 月 28 日，3 月 2 日和 3 月 4 日举办了关于治疗性肽和寡核苷酸的年度研讨会，有几场演讲侧重于多肽杂质控制策略，亚硝胺杂质首当其冲地成为了从业者的关注点。Bachem在该研讨会中阐述了他们控制多肽药物生产中亚硝胺产生风险的理念。他们认为，为了控制制造过程中产生亚硝胺杂质的潜在风险，在工艺开发过程中需要一种控制策略，以便将亚硝胺形成或污染的潜在原因降至可接受的水平。失效模式和影响分析 （Failure Mode Effect Analysis， FMEA） 是进行此类复杂的多参数风险分析的理想工具。
FMEA 中的失效模式（Failure Mode）包括：
· 试剂和原料中含有胺结构的物质 （仲胺与叔胺是产生亚硝胺的反应物之一）
· 试剂和原料中亚硝酸盐污染的风险 （亚硝酸盐是产生亚硝胺的另一反应物）
· 试剂、原料、二级反应，或产品接触表面被直接污染亚硝胺的风险
每个单独产品的 FMEA 均基于 ICH Q9（质量风险管理）和 ICH M7（R1）（致突变杂质）条例制定的，其中最终 API 中亚硝胺的风险取决于递进的三个参数：
· 失效模式概率 （PRN FM）： 对应以上三种失效模式发生的可能性
· 失效模式导致亚硝胺生成的概率 （PRN NA）：失效模式一旦产生，其导致亚硝胺产生的可能性
· 生成的亚硝胺被带入 API的概率（PRN API）： 亚硝胺一旦产生，其无法被工艺清除而污染最终产品的可能性
每个失效模式所蕴含的严重性通过“严重性系数 Severity Number （SN） ”＝ PRN FM x PRN NA来表征。而每个单个失效模式相关联的风险由“风险系数 Risk Number （RN）” ＝ SN x PRN API 定义，然后根据风险系数的具体数值，以及人为建立的档次标准，将每个失效模式对应的亚硝胺生成进一步分类为 （i） 无风险，（ii） 极低风险，（iii） 低风险，（iv） 中等风险，以及 （v） 高风险，每个风险都需要采取适当的行动。
Bachem 的 FMEA 方法进一步建议组建一个 FMEA 小组，其成员包括来自制造部门的具有评估产品专业知识的 SME、QA 部门的成员和采购部门的成员，小组的活动是为了：
· 确定每个设施的试剂来源（每个 FMEA 都是特定于产品和制造设备）。
· 生成特定于产品的材料清单，并获取制造商关于材料可能含有亚硝胺、硝酸盐或其他可疑前体的风险的声明。
· 审查在现场使用亚硝酸盐的任何内部产品和流程。检查 EPR 系统中是否存在这些试剂。
· 评估和判断固相多肽合成的洗涤工艺以及 HPLC 纯化去除亚硝胺杂质的潜力，以防止亚硝胺杂质进入最终 API。
其他降低污染风险的建议包括：
· 定期使用制备型 HPLC 通过早期识别来降低亚硝胺残留进入 API 的风险。
· 使用新鲜的试剂和溶剂可以避免回收过程可能带来的潜在污染风险。
总结
自从2018年沙坦类药物检测出亚硝胺杂质而引发大面积药物召回事件后，各大药品监管部门都明显提高了对亚硝胺杂质产生的风险评估要求，并加大了在此领域的质量分析力度。除了含有四唑结构的各类沙坦药物被召回之外，不含此结构的雷尼替丁、奥芬那君等药物因为药物分子本身产生的亚硝胺杂质（NDSRI，nitrosamine drug substance related impurities）而遭受了药品召回。EMA与FDA等监管部门随即指定了针对药物本身的亚硝胺杂质（NDSRI）限额标准（EMA 为每日允许摄入量 18 ng／天， FDA 为26．5 ng／天）。
由于多肽药物结构以及多肽合成自身的属性，它们遭受亚硝胺杂质侵扰的可能性相对于小分子较低。这个评估从两个方面来看，首先，多肽分子中并不富含二级胺结构，因此不易产生亚硝胺。例外的情况来自于N－端的二级氨基酸（如脯氨酸，Sarcosine等）和烷基化的赖氨酸，但这种情况同上并不多见，因此产生多肽药物为基质的亚硝胺NDSRI杂质的可能性不高。其次，由于多肽本身大分子量的特点，即便产生多肽亚硝胺杂质，其致癌性致突变的可能性也是极低的，因为它们形成的碳正离子很难与DNA的碱基之间产生有效的修饰反应，因此即便形成，也应该有很高的每日允许摄入量。
多肽合成需要注意的是那些使用酰基叠氮法液相缩合多肽的工艺，由于使用了亚硝酸盐作为原料，因此有形成亚硝胺杂质的风险。但由于多肽合成中需要多步分离处理，以及最后的液相色谱纯化，因此亚硝胺杂质即便形成，最终污染API的可能性 也较低。这种风险评估可以遵循FMEA的模式进行，FDA和EMA是可以接受没有分析数据，但符合科学逻辑的评估手段。但对于那些使用亚硝酸盐作为原料的多肽生产，还是强烈建议分析数个批次（具有统计学意义）的中间品或／和粗品或／和纯品的亚硝胺以及亚硝酸盐（后者容易遭受忽略）含量，以确认风险评估的有效性，并以实际数据证明产品质量不遭受亚硝酸盐和亚硝胺杂质的影响。
｜ 引用资料
［1］ Wang M， Cheng G， Villalta PW， Hecht SS． Development of liquid chromatography electrospray ionization tandem mass spectrometry methods for analysis of DNA adducts of formaldehyde and their application to rats treated with N－nitrosodimethylamine or 4－（methylnitrosamino）－1－（3－pyridyl）－1－butanone． Chem Res Toxicol． 2007；20 （8）：1141–1148．
［2］ Loeppky RN， Goelzer P． Microsome－mediated oxidation of N－nitrosodiethanolamine （NDELA）， a bident carcinogen． Chem Res Toxicol． 2002；15（4）：457–469．
［3］ Yi－Chao Huang， Ge－Min Fang， Lei Liu， Chemical synthesis of proteins using hydrazide intermediates． National Science Review， 2016， 3， 107–116．
END
原文标题 : Yi专栏 | 亚硝胺杂质对多肽药物生产的影响
