文章背景简介
耐热的汉逊酵母Ogataea polymorpha是一种具有基础研究和应用价值的微生物。它已成为研究甲醇利用、细胞自噬、硝酸同化的重要有机体。它的一个吸引人的特性是能够通过非同源末端连接（NHEJ）将多达100个目标拷贝基因整合到基因组中。此外，它可以利用人体低聚糖合成糖蛋白，还可以在高达50℃的温度下生长，从而可降低工业发酵昂贵的冷却成本。
CRISPER－Cas9辅助基因组编辑技术的研究进展为建立多重基因组工程提供了一种有效的途径。其基本原理是：反式激活crRNA：crRN双链直接引导Cas9蛋白与目标DNA序列结合，然后Cas9蛋白在PAM上游的三个核苷酸中产生双链断裂（DSB）。DSB可以通过非同源末端连接插入或修复，也可以通过同源重组来进行精准编辑，如基因敲除，点突变等。
核糖体DNA（rDNA）是编码核糖体RNA的DNA序列。在酵母中，rDNA通常由大量的相同重复序列组成。在O． polymorpha中，rDNA包含50－60个8kb的重复单元。在酿酒酵母（S． cerevisiae）中，rDNA位点由150－200个重复序列组成，重复序列为9．1kb。近年来，rDNA重复序列已成为一些酵母菌多拷贝基因整合的目标位点。
2018年6月，中国科学院微生物学研究所病原微生物学与免疫学重点实验室的Laiyou Wang等人，在《Biotechnology for Biofuels》杂志（IF2018＝5．497；工程技术 1区）发表了题为“Efficient CRISPR－Cas9 mediated multiplex genome editing in yeasts”的文章。
所用到的主要方法
1．活细胞的制备及转化
2．质粒构建和模板编辑
3．编辑效率计算：
编辑效率＝所需突变体数目／总被测菌落数
4．流式细胞仪分析
5．基因拷贝数估计
6．稳定性检测
7．摇瓶发酵
8．产品浓度分析：HPLC
文章主要内容摘要
在本研究中，作者发展了一种CRISPR－Cas9辅助多重基因组编辑（CRISPR–Cas9－assisted multiplex genome editing，CMGE）方法，包括多重基因敲除、多位点（ML）和多拷贝（MC）整合方法。在CMGE的基础上，对汉逊酵母（O．polymorpha）进行了基因敲除、整合和精确点突变等基因组修饰。采用CMGE－ML整合方法，在白藜芦醇生物合成途径三个不同的位点同时整合 橙色滑柱菌（Herpetosiphon aurantiacus）的酪氨酸解氨酶（TAL）基因，拟南芥的4－香豆酰CoA连接酶（4CL）基因和酿酒葡萄的芪合酶（STS）基因，成功实现白藜芦醇在O． polymorpha内的生物合成。采用CMGE－MC方法，将不同拷贝数的融合基因表达盒Psctef1－TAL－Psctpi1－4CL－Psctef2－STS整合到基因组中，白藜芦醇产量比单拷贝整合提高了20倍，达到97．23±4．84 mg／L。此外，本研究还利用CMGE－MC技术分别整合了人血清白蛋白（HSA）和大肠杆菌赖氨酸脱羧酶（cadA）基因，实现了人血清白蛋白和尸胺的生物合成。除汉逊酵母外，本研究还在酿酒酵母内也成功地建立了 CMGE－MC方法。CMGE方法为O． polymorpha和其他酵母的基因工程和合成生物学研究提供了一个有效的工具。
在酿酒酵母中同步敲除多基因的CRISPR－Cas系统
