-01-导读
过继转移嵌合抗原受体（CAR）T细胞是一项强有力的技术，它彻底改变了免疫治疗的方式。其在难治性和复发性血液系统恶性肿瘤中完全和长期的疗效令人印象深刻，这也为实体肿瘤的治疗开辟了新的可能性。然而，细胞治疗的广泛应用受到了T细胞转染常用病毒载体自身局限的阻碍。在mRNA疫苗和CRISPR/Cas9精准基因编辑的时代，新的无病毒T细胞工程化方法正在成为下一代CAR-T细胞制造的更通用、灵活和可持续的替代方法。
-02-困局突围：病毒载体的阿喀琉斯之踵
迄今为止，临床试验中批准或研究的大多数CAR-T细胞治疗都是利用病毒载体，特别是逆转录病毒和慢病毒载体。病毒载体是具有高效基因转移和长期应用历史的标准化系统，已经证明了在过继性T细胞治疗的安全性。
然而，病毒载体转导长基因的能力受到衣壳的限制。病毒衣壳直径大约为100nm，通常不能容纳超过8-9 kb的基因。然而，随着CAR-T技术的更新迭代，需要转入额外的激活原件或者不同特异性的CAR，实现更高的药效、安全性和适用性。
此外，临床应用的病毒生产通常需要两到三周的时间，在GMP条件下和生物安全2级（BSL2）设施中进行，需要经过熟练培训的员工。这种高成本、复杂性以及个性化治疗的需要最终影响了CAR-T产品的价格，可能达到每人数十万美元，使普通的患者望而生畏。
最后，病毒载体具有固有的免疫原性风险，这是由对载体编码表位的体液和细胞免疫反应引起的，这可能限制转导细胞的效力和持久性。
-03-破冰利器：非病毒CAR-T工程化平台解析
睡美人转座子
与病毒系统相比，这种策略的一大优势是更大的装载能力。插入物的大小与转座机制的效率呈负相关。最佳装载大小不高于6kb。但其升级版本包括两个完整的转座子单元，可以将负载增加到11kb，从而扩充了基于SB载体的克隆能力。此外，当与细菌人工染色体（BACs）结合时，SB在人类胚胎干细胞中可以传递高达100 kb的转基因。
在临床应用方面，Cooper等人的团队首次将SB工程化抗CD19 CAR-T细胞应用于临床试验，两项临床试验（NCT00968760、NCT01497184）证实了SB工程化抗CD19 CAR-T细胞在26例B-ALL和非霍奇金淋巴瘤患者自体或异基因造血干细胞移植（HSCT）后作为辅助治疗的安全性。
PiggyBac转座子
与SB载体一样，PB系统由PB转座酶（PBase）构成，其形式为mRNA或DNA，以及携带所需基因的单独转染质粒。PB在哺乳动物细胞中具有比SB更高的转座子动员转座活性，比病毒载体具有更大的装载能力（高达14 kb），并允许通过设计多顺反子盒进行多个转基因传递。
在澳大利亚开展的CARTELL试验是一项I期临床研究（ACTRN12617001579381），旨在研究通过PB转座子系统获得的供体衍生抗CD19 CAR-T细胞的疗效和安全性。早期结果表明，其活性类似于用高应答率病毒载体生成的抗CD19 CAR-T细胞。另外，分别在日本（UMIN000030984）和中国（NCT04289220）进行的两项I期研究正在调查使用PB系统制造的抗CD19 CAR-T细胞的可行性和安全性。在日本的研究中，到目前为止，没有一名患者显示出剂量限制性毒性。一名患者表现出持续9个月的B细胞再生障碍。
mRNA
RNA适合多种细胞转染方法，包括电穿孔、阳离子脂质和阳离子聚合物。已经有许多体外和体内临床前研究，通过mRNA将CAR引入T细胞，用于在血液肿瘤和实体瘤的模型系统中进行测试。虽然基于mRNA的治疗被证明可以减少靶向效应、降低毒性并缓解整合相关的安全性问题，但蛋白质表达的瞬时性在这些应用中也是一个缺点。
-04-技术创新：多学科交叉突破
纳米载体
为了应对未来的挑战，除了转座子平台外，基因工程的另一个非病毒工具是纳米载体，纳米载体的使用正在成为一种可能的解决方案，以克服目前基因传递中的障碍，例如毒性和低转染效率。
在纳米技术的最新进展中，作为最前沿的发现之一，Bozza等人开发了一种非整合DNA纳米载体，能够生成在体外和体内都具有活性的CAR-T细胞。该平台不含病毒成分，能够在分裂细胞的细胞核中进行额外的染色体复制，在不需整合的情况下维持持续的转基因表达。此外，它还具有非病毒载体的所有优点：非免疫原性、简单、多功能且生产成本低廉。
新型生物材料
另一方面，通过使用开发的新型生物材料来改善CAR-T细胞的分离、激活和基因修饰，正在取得进展。一个例子是使用合成DNA适配体和互补逆转技术，允许从PBMC中分离出高纯度和高产量的无标记CD8+T细胞。这种方法的最大优点是可以通过具有不同特异性的适配体在单个分离步骤中分离多个不同的T细胞群。
基因编辑
基因编辑和靶向敲除分别依赖于宿主DNA双链断裂（DSB）修复和同源定向修复（HDR）过程，HDR通常在原代细胞中发生频率较低，并且仅限于小的转基因，导致转染效率较低。为了更高效地提供DNA插入，CRISPR/Cas9最近与转座子结合，以提高RNA引导整合的效率，使用转座酶催化整合。为此，有研究小组进行了将CRISPR/Cas9与SB转座子结合的实验，结果表明，它们适用于未来的非病毒临床应用。识别和降低基因组重排和易位风险的方法可以允许在免疫治疗中进一步开发基因编辑的潜在临床应用。
-05-结语：非病毒性CAR-T的星辰大海
迄今为止，成功的CAR-T细胞治疗都与用病毒载体工程化的T细胞有关。然而，复发、制造过程的复杂性以及这些技术在包括实体瘤在内的其他疾病中的应用，需要更复杂的设计和基因转移技术来适应这些挑战。为了填补这些空白，非病毒技术正在不断取得进展，并正在改写CAR-T疗法的底层逻辑：从“天价特药”走向“普惠医疗”，从血液瘤单点突破到全面攻克实体瘤与自身免疫病。尽管仍需克服持久性、工艺标准化等挑战，但结合基因编辑、纳米技术与合成生物学的发展，非病毒CAR-T有望在未来5-10年内引领细胞治疗进入“工业化时代”。
参考文献：
1.The Past, Present, and Future of Non-Viral CAR T Cells. Front Immunol.2022; 13: 867013.
原文标题 : 非病毒性CAR-T如何重塑细胞治疗行业格局
