黑曲霉胺氧化酶降解伏马毒素的鉴定及性质研究

文章背景简介

BACKGROUND INTRODUCTION

伏马菌素 (Fumonisin, FB) 是一种霉菌毒素，是由串珠镰刀菌 (Fusarium moniliforme Sheld)产生的水溶性代谢产物，是一类由不同的多氢醇和丙三羧酸组成的结构类似的双酯化合物。伏马菌素对人、畜是促癌物也是致癌物。动物试验和流行病学资料已表明，伏马菌素主要损害肝肾功能，能引起马脑白质软化症和猪肺水肿等，并与食道癌有关。

伏马毒素通常由一个线性的20碳聚酮骨架组成，其中包含两个三羧基酯基团和一个由l-丙氨酸缩合而成的伯胺。伏马毒素B1（FB1）是毒性最大且研究最充分的同系物，另外的“B”系列伏马毒素成员根据聚酮主链上羟基的存在和位置而发生化学变化。伏马毒素是神经酰胺合成酶的竞争性抑制剂，可引起鞘氨氨酸和鞘氨醇水平的改变，并具有显著的下游毒性影响。FB1的伯胺部分对其在植物和动物中的生物活性都是必需的。取代的伏马毒素，如N-乙酰基FB1、N-羧甲基FB1（NCFB1）或伏马毒素P1，在体外对啮齿动物基本无毒。FB1的化学脱氨基作用降低了其对水螅毒素的毒性。通过在浮萍生物测定中比较胺化和非胺化伏马毒素，进一步证明了胺的重要性。

对伏马毒素进行酶修饰是减轻其毒性的一种方法，此前人们已经从分解代谢伏马毒素的微生物中鉴定发现了伏马毒素降解酶先前，但未从在合成伏马毒素的物种中鉴定发现。细菌鞘氨醇单胞菌ATCC 5555219和鞘氨醇葡菌MTA 14420均含有负责逐步降解伏马毒素的保守基因簇。在这个簇中两个基因产物羧酸酯酶（FumD）和转氨酶（FumI），分别去除伏马毒素三羧酸酯侧链和胺官能团。在通过FumI进行脱酯化之前，需要通过FumD进行完全脱酯化。羧酸酯酶FumD以FUMzyme的形式在市场上可买到，并作为饲料添加剂出售，以实现胃肠道去酯化。该系统的缺点是需要昂贵的辅因子（磷酸吡哆醛）和辅底物（丙酮酸）来维持FumI的活性。黑酵母Exophialaspinifera也能够代谢伏马毒素作为能量来源。

目前已经从利用伏马毒素作为能量来源的微生物中鉴定出能够分解伏马毒素的酶。然而，由生物合成毒素的物种产生的伏马毒素降解酶尚未被报道。为了进一步挖掘降解伏马毒素的优良酶分子，加拿大农业及农业食品部的Christopher P Garnham等人开展了相关研究，并于2020年11月在《Agricultural and Food Chemistry》（IF=6.1，Q1）杂志上发表了题为“Identification and Characterization of an Aspergillus niger Amine Oxidase that Detoxifies Intact Fumonisins”的文章。

所用到的主要方法

METHODS

1、LC-MS检测

2、伏马毒素脱氨活性富集实验

3、分馏法鉴定胺氧化酶的nanoLC−MS/MS黑曲霉上清液

4、重组酶的构建和纯化

5、温度敏感性试验

6、Amplex Red测定法测量AnFAO氧化脱氨基作用

7、PCR扩增胺氧化酶的序列

文章主要内容摘要

ABSTRACT

玉米在温暖干燥条件下生长时，受黄萎病镰刀菌及其相关物种危害的伏马毒素污染是一个主要问题。食用受伏马毒素污染的食品和饲料对人类和牲畜都有害。减少或消除伏马毒素毒性的新工具可能对农业饲料部门处理这一问题有用。

本文从产生伏马毒素的黑曲霉中鉴定发现了一种新型胺氧化酶，并对其特征进行了研究。作者在大肠杆菌中重组表达了这种黑曲霉酶，并证明了其具有对伏马毒素进行完整的氧化脱氨的能力，且这一作用不需要外源辅助因子，这种酶被称为AnFAO（黑曲霉胺氧化酶）。AnFAO是一种很有前途的工具，可用于修复伏马毒素污染的饲料，包括用于玉米乙醇生产。

AnFAO相对容易生产和纯化，加上它对完整伏马毒素的脱氨活性，以及它不需要外源的辅因子和辅底物，使该酶成为一种理想的工具，用于净化富含伏马毒素的食品和饲料。AnFAO在不同温度、pH值、NaCl和EtOH浓度下的广泛活性范围，并且缺乏对二价阳离子的需求，进一步增强了该酶用于解毒目的的适用性。黑曲霉是生产工业酶和有机化合物的常用宿主，使得在其原生宿主内生产AnFAO在工业规模上是安全可行的。最后，通过多种过敏原预测算法分析，AnFAO也被预测为非致敏性，进一步强调了将该酶用作食品或饲料添加剂的潜在可行性。

简而言之，本研究的主要内容有:

1、黑曲霉培养上清可提高伏马毒素脱氨活性

2、胺氧化酶可使伏马毒素脱氨基

3、AnFAO在广泛的条件下对伏马毒素进行脱氨

4、重组AnFAO脱氨其他的长链氨基多元醇

5、AnFAO证明了伏马毒素脱氨活性的菌株依赖变异性