前言
Toll样受体9（TLR9）是Toll样受体家族的成员之一，其可被病原体来源的非甲基化磷酸胞苷鸟苷DNA（CpG DNA）或人工合成的含非甲基化CpG的寡核苷酸（CpG ODN）激活，并通过其下游信号传导直接或间接启动固有免疫反应，从而抵抗病原体的入侵。
长期以来，TLR9一直被认为是位于内溶酶体中的细胞内DNA传感器。然而，随着研究的深入，发现TLR9也可以在细胞膜表面表达，如中性粒细胞、B细胞甚至红细胞，被称为表面TLR9（sTLR9）。此外，细胞免疫反应的激活可以在细胞内外的这两个TLR9位点启动，TLR9在细胞膜上的定位有助于激活内体TLR9（eTLR9）介导的信号通路。sTLR9的存在可能有利于某些细胞类型或组织中的宿主反应，例如红细胞可以通过sTLR9介导巨噬细胞等先天免疫细胞的激活，从而在炎症状态下加速自身的清除。因此，深入了解sTLR9的结构特征、sTLR9与CpGDNA的关系，以及sTLR9在免疫细胞中的免疫调节作用，将为TLR9激动剂的临床应用提供理论参考。
sTLR9的结构
sTLR9的结构并不特别清楚，它是否与eTLR9相同也存在争议。众所周知，eTLR9属于I型跨膜蛋白，由细胞外、跨膜和细胞内区域组成。eTLR9的胞外区位于内体中，由25个富含亮氨酸的重复序列（LRR）组成，其N-末端和C-末端分别称为TLR9-N和TLR9-C。TLR9-N和TLR9-C可以通过天冬氨酸内切酶释放，该内切酶作用于eTLR9中间的LLR14和LLR15之间的Z环结构域，形成TLR9-N+C复合物，这是eTLR9的活性形式。
然而，sTLR9的结构尚不清楚。一项研究表明，与TLR9-N结合的抗体完全不能与人外周中性粒细胞上的sTLR9结合，这可能表明这些中性粒细胞的sTLR9不是TLR9-N+C复合物的活性形式。而抗全长TLR9和抗TLR9-N的抗体都能识别B细胞上的sTLR9，这表明全长TLR9和TLR9-N存在于B细胞上。此外，识别TLR9-N的抗体可以检测到树突状细胞（DC）上的sTLR9，但检测不到脾脏中性粒细胞上的sTLR9，这表明DC和中性粒细胞的sTLR9构象不同。这些研究给人的印象是，sTLR9的结构可以是全长无活性形式，也可以是酶水解活性形式，这可能因细胞而异。
sTLR9的转移
对于细胞内TLR9，它可以位于内质网（ER）或内体的膜上。对于组成性表达TLR9的细胞，如pDC和B细胞，在稳态下，TLR9主要位于ER膜上。然而，当TLR9配体如CpG-ODN刺激时，TLR9可以从ER膜迁移到内溶酶体膜，成为eTLR9。这种重新定位过程依赖于几种伴侣蛋白，包括Unc93B1、gp96和PRAT4A。Unc93B1是TLR9功能所需的多次跨膜蛋白，是控制TLR9从内质网向内溶酶体运输的最关键的调节因子。Gp96和PRAT4A也与TLR9相互作用，并共同调控TLR9的折叠。
sTLR9也可以在Unc93B1和衔接蛋白2（AP2）的帮助下从细胞表面迁移到内体，成为eTLR9。研究发现，细胞膜表面的Unc93B1通过其C末端YxxΦ基序募集AP2，然后与网格蛋白形成复合物，以帮助sTLR9转运到内溶酶体膜上。在存在TLR9配体（如CpG-ODN）的情况下，sTLR9向IRF信号通路的偏向与I型干扰素的诱导有关，而sTLR9向NF-κB信号通路的偏向则与炎症因子的诱导有关。
此外，在人pDC中，DC相关LAMP样分子（BAD-LAMP）与Unc93B1一起，促进TLR9从IRF信号向NF-κB信号的偏移，最终导致促炎细胞因子的产生。目前，尚不清楚CpG DNA是如何产生启动TLR9转运信号的，但据推测，不同位点TLR9数量的失衡可能是触发TLR9迁移和重新定位的驱动力。
sTLR9与CpG-ODN的关系
到目前为止，sTLR9是否与TLR9配体CpG-ODN结合仍不确定，但对在中性粒细胞、B细胞和红细胞上表达的sTLR9的几项研究表明，中性粒细胞上的sTLR9可以直接与CpG-ODN结合并被激活。对HEK293转染细胞上表达的sTLR9的研究表明，sTLR9参与CpG-ODN刺激中的细胞内信号通路，涉及MyD88、IRAK和TRAF6，表明定位在细胞表面的TLR9具有生物活性。此外，B细胞和红细胞似乎也有类似的现象。
因此，sTLR9似乎具有识别和结合CpG-ODN的能力，但它是否能直接启动信号转导还需要进一步研究。sTLR9是否能够与TLR9配体结合是一个值得研究的课题，这有助于揭示TLR9在细胞膜表面出现的潜在生理意义，也有助于解释其在自身免疫性疾病中的可能作用。
sTLR9的免疫调节作用
sTLR9对中性粒细胞和B细胞的免疫调节作用已经得到了相对深入的研究。红细胞作为人类免疫系统中一种新兴的研究前沿，也表达sTLR9，它可以激活先天免疫反应。
中性粒细胞
据报道，中性粒细胞能够在病原体感染早期通过sTLR9介导先天免疫反应。已经发现，当CpG DNA不能进入内体或eTLR9不能被激活时，表达sTLR9的中性粒细胞可以感知细胞外病原体衍生的CpG DNA，并独立于eTLR9启动sTLR9介导的信号传导。
一些研究表明，sTLR9+中性粒细胞可能在病原体感染中发挥阳性或阴性免疫调节作用，这取决于其位置或时间。一项基于D-半乳糖胺（D-GAL）联合CpG-ODN诱导全身炎症反应综合征（SIRS）小鼠模型的研究表明，sTLR9+中性粒细胞可在炎症部位产生TNF-α和IL-10。然而，SIRS诱导后1小时收集的sTLR9+中性粒细胞比6小时收集的产生更多的IL-10和更少的TNF-α，这表明炎症初始阶段的sTLR9+中性粒细胞可能更倾向于负向的免疫调节作用。此外，，在肿瘤中，sTLR9+中性粒细胞与免疫抑制分子如PD-L1和IL-10的高表达，以及免疫激活分子如TNF-α和ICAM1的表达减少有关，其比例也随着肿瘤的进展而增加，提示sTLR9+中性粒细胞具有负性免疫调节特性。通过使用TLR9激动剂下调早期肿瘤中性粒细胞上sTLR9的水平可以抑制肿瘤生长。
总之，无论是炎症还是肿瘤，中性粒细胞表面sTLR9的存在似乎都是一种分子标记，可以确定其是否发挥积极或消极的免疫调节作用，同时也赋予sTLR9免疫检查点分子的特征。TLR9可能通过选择性迁移发挥免疫检查点或免疫激活的双重作用，成为中性粒细胞等先天免疫细胞独特而快速的活性调节模式。
B细胞
最近的研究发现TLR9在B细胞表面表达，并参与B细胞的激活。根据研究报告，与健康对照组相比，脓毒症患者外周血B细胞中sTLR9的表达显著增加。sTLR9的激活可以抑制CpG-ODN单独或与抗IgM抗体联合诱导的B细胞增殖和CD25表达。在抗IgM抗体结合的B细胞受体（BCR）的情况下，sTLR9转移到B细胞的脂筏，表明sTLR9可能在B细胞活化过程中分离，并且这种重新定位对于B细胞活化可能是至少部分必需的。
也有研究表明，sTLR9可能是静息状态B细胞拮抗eTLR9激活的一种负调控因子。当B细胞通过eTLR9信号被激活时，sTLR9可以帮助eTLR9发挥其功能。此外，在一项研究中发现，在疫苗加CpG-ODN的刺激下，B细胞上的sTLR9内化到细胞并与内涵体膜蛋白共定位，伴随着B细胞中sTLR9水平的降低和B细胞的活化，揭示了sTLR9在TLR9激动剂的作用下内化为eTLR9。这些数据表明，CpG-ODN介导的B细胞活化的机制之一可能部分在于其诱导sTLR9在B细胞中重新定位，而sTLR9可能是避免TLR9介导过度B细胞激活的负调控因子。
红细胞
最新研究表明，红细胞不仅具有运输氧气的功能，还具有免疫哨兵的作用，可以及时感知体内病原体或损伤，发挥免疫细胞的功能。有趣的是，TLR9在红细胞表面表达，这与先天免疫的激活和炎症状态下红细胞的加速清除有关。
入侵人体的病原体和受损细胞都可以释放CpG DNA，因此体内游离CpG DNA水平升高，在恶性肿瘤、自身免疫性疾病和败血症中通常可以检测到。2018年，一项研究表明，红细胞是清除CpG DNA和减轻肺组织损伤所必需的。sTLR9在人类和小鼠红细胞表面表达，并能与大量游离CpG DNA结合。CD47与CpGDNA结合后，红细胞表面的分子构象发生变化，失去了原来的“不要吃我”的功能。当这些红细胞穿过包括肝脏和脾脏在内的网状内皮系统时，它们被巨噬细胞上表达的SIRPα快速识别，然后被巨噬细胞吞噬。因此，红细胞以自杀倾向的方式清除CpG-DNA，这抑制了过度的炎症反应，并诱导贫血的发生。尽管如此，能够表达sTLR9的红细胞只占很小的比例，它们在免疫调节中的作用仍有待进一步研究。
小结
TLR9可能出现在细胞膜上并作为稳定和功能性受体的可能性特别令人感兴趣。发现源自细胞表面TLR9的途径可能揭示内体TLR9新的功能，增强我们对炎症或癌症触发的理解，并可能发现以前未知的sTLR9受体特异性配体。存在于质膜上的TLR9可以作为治疗靶点，帮助我们开发针对难以治疗的罕见疾病的新治疗方法。
参考文献
1.Surfacetoll-like receptor 9 on immune cells and its immunomodulatory effect. FrontImmunol.2023 Sep 1;14:1259989
原文标题 : 免疫细胞表面的TLR9及其免疫调节作用
