前言
调节性T细胞（Treg）是免疫细胞的一小部分，专门用于抑制过度免疫激活和维持免疫稳态。在过去二十年中，嵌合抗原受体（CAR）的开发和基因组编辑的进展促进了T细胞治疗的优化， 这些技术现在被用于增强Treg细胞的特异性和功能性， 以Treg细胞为基础的自身免疫和移植治疗正得到快速的发展。
Treg的分类和功能
Treg是T细胞的一个子集， 占CD4＋T细胞总数的5－10％，具有维持体内平衡和预防自身免疫的功能，其特征是CD4、CD25、FOXP3和低水平CD127的共同表达。高水平的FOXP3和特异性去甲基化区域（TSDR）的去甲基化是Treg的显著特征，TSDR是FOXP3基因中的一个保守区域。
Tregs可分为两类：天然调节性T细胞（nTregs）和诱导调节性T细胞（iTregs）。两种类型的Tregs都普遍表达 Foxp3。nTregs在胸腺中自然发育，其抑制作用是通过细胞间接触实现的，它们的主要功能是维持正常的免疫耐受和控制炎症反应。
iTregs来源于肿瘤微环境信号诱导的外周原始T细胞，包括肿瘤抗原、细胞因子（如IL－10，TGF－β）和其他可溶性分子。iTregs通过多种促进肿瘤进展的机制抑制效应T细胞（Teff）、NK细胞和DC的抗肿瘤免疫作用。
Tregs主要有以下五种功能机制：①Tregs分泌抑制性细胞因子，包括 IL－10、TGF－β 和 IL－35。②Tregs 通过颗粒酶和穿孔素杀死效应细胞。③ Tregs 影响效应细胞的功能：Treg 与效应T细胞竞争消耗 IL－2，从而抑制效应T细胞的生长；Tregs通过产生胞外酶CD39和CD73 促进TME中腺苷的产生，诱效应细胞导的抑制和抗增殖作用；Tregs通过缝隙连接将大量 cAMP 转移到效应T细胞，干扰其代谢。④Tregs通过刺激性和抑制性受体（CTLA－4 或 LAG3）诱导DC耐受，后者通过IDO进一步抑制T细胞的能力。⑤MDSCs和Tregs 产生的因子形成正反馈环，促进增殖，增强抑制环境。
此外，一项研究使用一种新的策略来定义Tregs， Th1样Tregs（T－ 234bet＋IFNγ＋Foxp3＋），Th2 样Tregs（Gata3＋IRF4＋IL4＋Foxp3＋）和Th17样Tregs（IL－17＋RORγt＋Foxp3＋），这为靶向 Tregs 治疗提供了新思路。
过继性Treg：从多克隆到抗原特异性
最初过继性Treg的临床试验主要使用多克隆或体外扩增的Tregs。第一份关于用体外扩增的Treg治疗GVHD的报告表明，慢性GVHD患者的症状得到缓解，并有可能减少免疫抑制剂的使用。几年后，11名接受干细胞移植治疗恶性血液病的GVHD患者获得了脐带血来源的Treg，并进行了扩增和给药。接受Treg治疗的患者II－IV级急性GVHD的发病率降低5倍，Treg治疗组一年后无慢性GVHD，而对照组为14％。
虽然多克隆Tregs获得了一定程度令人鼓舞的效果，但是输注所需的细胞数量相当大，此外，还有非特异性免疫抑制的风险，事实上，多克隆Tregs输注后的病毒再激活已有报道。
这些缺点可以通过使用抗原特异性Treg来克服，与多克隆Treg相比，抗原特异性Treg只需要较少的细胞就可以实施更多的局部和靶向抑制。此外，许多研究已经证明，在动物模型中，特异于所需抗原的Treg在功能上优于多克隆或未修饰的Treg。
传统的产生抗原特异性Treg的方法主要依赖于用APCs和特异性抗原扩增，或用T细胞受体（TCRs）工程化的Treg。然而，用APCs扩增Treg效率低下，而用TCR构建的Tregs（TCR－Tregs）仍然受到MHC的限制，限制了针对不同患者的模块化应用。
CAR－Treg的设计
另一种赋予Tregs特异性的方法是用CAR转导这些细胞。与TCR－Treg相比，CAR具有一些独特的优势：这些表达CARs的T细胞激活时绕过HLA限制，通过共受体信号的激活增加了特异性，以及CARs的靶向灵活性（任何可溶性或表面多价抗原都可以作为靶点）。
CAR－Treg细胞最直接的应用是GvHD和器官移植排斥反应。与大多数自身免疫性疾病不同，移植中有非常明确的靶点，即HLA分子。2016年，首次报道了HLA－A2CAR Treg细胞，研究证明，HLA－A2－CAR－Treg细胞抑制Teff细胞增殖，并在免疫缺陷NSG小鼠模型中阻止了HLA－A2＋PBMC介导的GvHD。
CAR－Treg细胞的新应用仍在出现，B细胞靶向抗体受体（BAR）Treg细胞是近年来研究的热点。人VIII因子（FVIII）注射液用于治疗A型血友病患者，而随着时间的推移，抗FVIII中和抗体的发展会导致发病率和死亡率上升。含有FVIII免疫显性结构域（A2或C2）作为胞外结构域的BAR被设计成靶向FVIII特异性B细胞，细胞内信号结构域仍为CD28－CD3ζ。引人注目的是，在体外，展示A2结构域或C2结构域的人BAR－Treg细胞抑制了用重组FVIII免疫的小鼠产生抗FVIII抗体。
CAR－Treg设计的另一个重要方面是共刺激领域的选择。目前使用的共刺激域与传统CAR－T细胞中使用的相同。虽然传统T细胞和Treg通常表达相同的共刺激受体，但细胞内的信号不同，导致不同的效应器功能。
到目前为止，大多数CAR－Treg的共刺激域是4－1BB或CD28。最近，人们研究了具有10个不同共刺激结构域（例如CD28、CD28Y173F、ICOS、CTLA－4、CTLA－4 Y165G、PD－1、4－1BB、GITR、OX40、TNFR2）的第二代CAR－Treg，当测试功能和基因表达谱时，表明CD28共刺激信号传递更优越。使用4－1BB或TNFR2会导致Treg稳定性和功能下降。
CAR－Treg在自身免疫疾病的研究进展
GvHD
Treg治疗已成为GvHD研究的一个重要领域，大多数研究集中于体外扩增的多克隆Treg。治疗GvHD的Tregs的首次临床试验显示，对急性GvHD症状的影响不大，但显著缓解了慢性GvHD的症状，并减少了免疫抑制剂的使用。
随后的研究开始使用CAR－Tregs，这是一种同种抗原特异性人类Tregs，被设计用于表达HLA－A2－特异性CAR。在体外和体内试验中，这些A2－CAR Treg保持FoxP3、CD25、Helios和CTLA－4的高表达。此外，他们在免疫缺陷小鼠模型中预防了异种GvHD。
继HLA－A2靶向CAR－Tregs成功后，最近的研究重点是产生具有不同靶向结构域的CAR－Tregs，如CD83，其可在小鼠模型中预防GvHD。还有CD19，其可抑制B细胞抗体的产生和导致GvHD的病理学。
这些有希望的结果促成了在英国和美国对肾移植患者进行的第一次CAR－Treg临床试验（NCT04817774）授权。这项试验可能支持CAR－Tregs在临床试验中优于多克隆扩增的Tregs，进一步扩大了在其他疾病条件下使用CAR－Tregs的可能性。其他生物制药公司紧随其后，例如Quell Therapeutics，专注于肝移植受者的CAR－Tregs。
糖尿病
1型糖尿病（T1D）是一种自身免疫性疾病，其特征是由于胰腺β细胞的破坏而导致胰岛素缺乏。研究表明，T1D患者中Treg的免疫抑制功能降低。在动物模型中，输注扩增的抗原特异性Treg在阻断和逆转糖尿病方面显示出有希望的结果。然而，由于在循环中罕见，分离足够多的抗原特异性Treg具有挑战性。
因此，研究重点是用FoxP3基因转导的多克隆CD4＋T细胞，将其转化为Treg。此外，可通过工程化TCR或CAR技术将抗原特异性赋予多克隆T细胞。Brusko的研究小组发现，谷氨酸脱羧酶（GAD）特异性TCR转导的Treg在体外可以抑制抗原特异性T细胞增殖的能力。另一项研究中，Hull等人将胰岛特异性TCR转移到调节性T细胞，并证实其在体外具有抑制CD4和CD8 T细胞增殖的能力。目前，GentiBio和Abata等公司正在开发TCR工程化Treg治疗T1D。
类风湿性关节炎
类风湿性关节炎（RA）是最常见的炎性关节炎，其特征是滑膜炎症、增生、自身抗体产生、软骨和骨破坏。多种免疫细胞亚群参与RA的发展，其中，T细胞和巨噬细胞之间的相互作用起着至关重要的作用。
许多研究调查了增加Treg数量或改善Treg功能对RA的益处。Wright等人利用卵清蛋白（OVA）特异性Treg，通过产生TCR转导的Treg或TCR－FoxP3转导的CD4＋T细胞，来抑制OVA诱导的关节炎。两种工程化Treg均通过旁观者抑制对不同抗原特异性T细胞的增殖表现出OVA依赖性的抑制。目前，Sonoma Biotherapeutics公司正在开发针对RA的CAR Treg疗法。
多发性硬化症
多发性硬化（MS）是一种自身免疫性脱髓鞘和神经退行性疾病，由识别髓鞘表位的自身反应性T细胞引起。使用实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）模型进行的临床前研究证实了Tregs抑制抗原特异性自身反应性免疫反应的有效性。
Fransson等人用CAR靶向髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（MOG）创建抗原特异性Treg。MOG－CARTregs在体外抑制了效应T细胞的增殖。在体内，MOG－CARTregs减少了EAE小鼠的疾病症状，并减少了脑组织中的促炎细胞因子mRNA水平。后来，Kim等人利用源自MS患者的髓鞘碱性蛋白特异性TCR构建了Treg，在体内TCR－Tregs显著降低了EAE－MS小鼠模型中的疾病评分。免疫调节工程化Treg在临床前研究中的结果，促进了一些生物制药公司的CAR－Treg的开发，如Abata Therapeutics和TeraImmune。
炎症性肠病
炎症性肠病（IBD）是以胃肠道慢性炎症为特征的疾病，溃疡性结肠炎（UC）和克罗恩病（CD）是IBD最常见的形式。研究表明，肠道微生物群和免疫反应之间的不平衡在IBD中起着重要作用。通常，肠道炎症与Treg数量的减少无关。然而，Treg活性不足的小鼠更容易发生严重结肠炎。因此，多项研究试图利用Treg抑制活性来维持UC的耐受性。
在一项研究中，来自转基因小鼠的针对已知结肠炎抗原（TNP）的CAR－Tregs在体外抑制了效应T细胞的增殖。在体内，诱导结肠炎后，与野生型动物相比，观察到CAR－Treg转基因小鼠的存活率增加。此外，将TNP－CAR Tregs转移到结肠炎小鼠模型中可以减少症状并提高存活率。基于CAR－Treg细胞的治疗可能是缓解UC和CD的一种有前途的有效方式。
哮喘
哮喘是一种慢性呼吸道疾病，哮喘患者的Treg受损并减少。因此，新方法专注于通过在哮喘临床前模型中转移调节性T细胞来预防气道炎症。此外，一项研究利用调节T细胞表位（Tregitopes）诱导高度抑制性过敏原特异性Treg。
用Tregitopes治疗可抑制过敏原诱导的气道高反应性和肺部炎症。为了将Treg导向哮喘相关抗原，Skuljec等人应用CAR技术，从转基因小鼠中分离出针对CEA的第二代Treg，CEA是一种存在于肺和胃肠道腺上皮表面的糖蛋白。他们的结果显示了哮喘小鼠炎症肺中CEA－CAR Tregs的激活和归巢。此外，与未修饰的Tregs相比，CEA－CAR Tregs在更大程度上改善了炎症。
下一代工程化Treg
合成生物学
开发Treg细胞作为治疗自身免疫性疾病的药物并不仅局限于TCRs和CARs的应用，合成免疫学已经产生了许多人工受体和系统，正在Treg细胞中进行测试。
这些系统包括通过连接的单链抗体将内源性TCR复合物招募到非MHC靶点的T细胞抗原偶联剂，可以被可溶性配体结合并激活的CARs，以及可分开的、通用和可编程的CAR（SUPRA）。
细胞因子
毫无疑问，细胞因子在免疫反应中起着关键作用。Treg细胞组成性地表达IL－2受体的高亲和链CD25，有效地剥夺Teff细胞的IL－2。此外，通过工程化CAR－Treg细胞的改造，可以将促炎细胞因子信号转化为IL－2或IL－10信号以增加对炎症的抑制。
基因编辑一些利用CRISPR–Cas9编辑人类T细胞基因的临床前研究已有发表，这些包括敲除CD4＋T细胞中CCR5的基因，产生抗HIV感染的T细胞；敲除CD7－CAR T细胞中CD7的基因，因为T细胞本身表达CD7，从而防止自相残杀；以及敲除CD19－CAR T细胞中PD1的基因，从而提高人源化小鼠模型的肿瘤清除率。提升递送系统
目前，CAR T细胞的制造使用逆转录病毒和慢病毒转导将遗传物质传递并整合到T细胞中。然而这些方法费时、昂贵且有安全问题的困扰。
一些非病毒的递送方法正在开发中，例如CRISPR－RNPs共电转，可以将超过1 kb的DNA敲入人T细胞的特定基因组位点，这种方法简单，安全，双链DNA模板没有毒性。利用该方法纠正了单基因自身免疫性疾病患者细胞中的致病性CD25突变，证明了其潜在的应用价值，但是这种方法也受到插入片段大小的限制。
设计Treg细胞
Treg细胞治疗面临的一个障碍是确保细胞在输注后的存活，利用基因编辑敲除Treg细胞中JNK1基因可使其抗凋亡，JNK1缺陷的Treg细胞分泌更高水平的IL－10和TGFβ ，可以保护移植胰岛不受排斥反应的影响比对照延长100天。
此外，Treg细胞在炎症环境中也可能变得不稳定，并转化为致病性TH17细胞。通过敲除PRKCQ基因，可以降低了Treg细胞向TH17细胞分化的倾向，同时保持了Treg细胞的抑制功能。
最后，通过基因编辑获得最新一代低免疫原性人多能干细胞，再加上不断的努力将干细胞分化为Treg细胞，这可能会彻底改变工程化Treg细胞治疗的手段。
小结
目前，利用Treg细胞设计治疗自身免疫疾病正方兴未艾，工程化CAR－Treg在这方面表现出独特的优势，具有极大的潜力。然而，在Treg细胞生物学和Treg细胞治疗领域仍存在许多问题。
在接下来的十年中，随着这些悬而未决的问题的解决，期待看到Treg细胞制造的持续改进，以及与合成生物学和基因编辑的广泛应用，将使Treg细胞疗法发挥出越来越重要的作用。
参考文献：
1． The Future of Regulatory T Cell Therapy： Promises and Challenges of Implementing CARTechnology． Front Immunol． 2020； 11： 1608．
2． Chimeric AntigenReceptor （CAR） Treg： A Promising Approach to Inducing Immunological Tolerance．Front Immunol． 2018 Oct 12；9：2359．
3． Next－generation regulatory T cell therapy． Nat Rev Drug Discov． 2019 October ； 18（10）： 749–769．
4． Chimeric Antigen Receptor （CAR） Regulatory T－Cells in Solid OrganTransplantation． Front Immunol．2022； 13： 874157．
5． CAR－T Regulatory （CAR－Treg） Cells：Engineering and Applications． Biomedicines． 2022 Feb；10（2）： 287．
原文标题 : 新一代调节性T细胞疗法：CAR-Treg
