在过去的十年中，使用免疫检查点抑制剂（ICIs）的癌症免疫治疗在各种恶性肿瘤的治疗中显示出良好的临床疗效。然而，由于免疫抑制性的肿瘤微环境（TME），这种免疫治疗效果只使得小部分患者收益。因此，在治疗前或治疗期间尽早识别可能或不可能对ICI治疗产生反应的患者对于获得最佳免疫治疗效果至关重要。
PD－L1的表达最初被认为是预测抗PD－1／PD－L1治疗反应的一个可能的生物标志物。然而，仅肿瘤PD－L1阳性不足以对患者进行区分，因为一些PD－L1阴性患者也对免疫治疗有反应，并且PD－L1水平在癌症治疗期间表现出时空变化。与ICIs增强临床益处相关的其他肿瘤因素包括错配修复蛋白缺陷、微卫星不稳定性（MSI）、高肿瘤突变负荷（TMB）和效应T细胞基因特征。
尽管基于肿瘤组织的生物标记物有助于确定患者是否能够获益，但在临床实践中仍存在许多挑战。首先，肿瘤活检通常是侵入性的，使用活检获取患者组织样本受到肿瘤可及性和患者状况的严重限制。重复的组织活检可能增加与手术相关的并发症的可能性，并延迟癌症治疗。此外，由于肿瘤异质性，一个转移病灶内的局部免疫反应可能并不代表患者的全身抗癌免疫
随着高通量多通路分析技术的出现，外周血现在适合于更深入的免疫分析。由于外周血取样容易获得、微创且可重复，因此使用基于血液的免疫生物标记物可以弥补癌症免疫治疗期间基于组织的免疫生物标记物的上述限制。
循环免疫细胞
外周血循环中存在着各种免疫细胞成分，包括T细胞、B细胞、自然杀伤（NK）细胞或髓系细胞。它们可以帮助预测晚期癌症患者ICIs的治疗反应和临床益处。利用多色荧光流式细胞术、质谱流式细胞术和下一代测序技术检测各种免疫细胞亚群的最新技术进展，使得能够识别和监测外周血中不同的循环免疫细胞亚型。
CD8＋T细胞
CD8 T细胞被认为是对抗肿瘤的最有效的细胞毒性效应物，是当前癌症免疫疗法的主要靶点。在一项对接受PD－L1抑制剂治疗的非小细胞肺癌（NSCLC）患者的研究中，循环中较少CD8＋T细胞与持久的临床益处（DCB）相关（准确率＝70％）。外周血中循环T细胞数量的减少可能是由于大多数T细胞归巢到肿瘤组织中。
尽管外周血中循环CD8＋T细胞的总数可能反映整体免疫状态，但参与癌症免疫的T细胞亚型非常异质，其中许多不是肿瘤特异性的。因此，在大多数其他研究中，研究人员对T细胞亚型进行了更详细的分析，而不是测量T细胞总数。
表达PD－1或PD－L1的CD8＋T细胞
PD－1和PD－L1之间的相互作用在肿瘤免疫周期中控制T细胞免疫耐受和耗竭。PD－1过度表达的循环T细胞在癌症患者中的检出率高于健康人。
研究发现，在接受nivolumab预处理的NSCLC患者中，基线检查时，临床受益患者的PD－1＋CD8＋T细胞检出率高于无反应患者。此外，最近的一项研究表明，在基线检查时，较高比例的循环PD－1＋CD8＋T细胞与使用pembrolizumab治疗的MSI高胃癌患者的临床获益相关。
由于PD－1／L1阻断可使表达PD－1的CD8＋T细胞恢复活力，并诱导其活化和增殖，因此在几项研究中已对ICI治疗后循环PD－1＋CD8＋T细胞的早期增殖进行了研究。Kamphorst等人观察到接受PD－1抑制剂治疗的NSCLC患者外周血中Ki－67＋PD－1＋CD8＋T细胞的增加，这些增殖性T细胞表现出效应表型。治疗后4周内出现早期增殖性T细胞反应的患者，PD－1靶向治疗后获益，而反应延迟或无反应的患者通常会经历疾病进展。类似地，在使用pembrolizumab治疗的晚期黑色素瘤患者中，也报告了PD－1抑制剂治疗后Ki－67＋PD－1＋CD8＋T细胞的增加。
总之，ICI治疗后循环PD－1＋CD8＋T细胞的早期增殖显示出作为良好临床反应和结果的预测性生物标记物的一致潜力。需要进一步的研究来确认哪一个时间点最适合检测PD－1＋CD8＋T细胞的动态变化。
表达TIM－3的T细胞
除PD－1外，还研究了其他免疫检查点分子。当对NSCLC和肾细胞癌患者在基线检查时以及在PD1抑制剂治疗开始后至少8周进行配对血样分析时，与无进展性疾病（PD）患者相比，PD患者表达TIM－3的CD4＋或CD8＋T细胞的频率显著增加。此外，TIM－3＋细胞的增加与PFS呈负相关。
然而，在食管鳞状细胞癌患者中观察到相反的结果。在食管癌中，第一个周期的nivolumab治疗后TIM－3表达的CD4＋或CD8＋T细胞的增加与更高的临床反应或更长的OS相关。这些有争议的结果应该在未来的研究中通过更大的样本量和不同时间点的纵向分析进行验证。
衰老的CD8＋T细胞
衰老的T细胞表现出终末分化表型，增殖活性低，TCR多样性池减少，但仍具有细胞毒性潜力，这与耗竭的T细胞不同。CD28的缺失、CD57表达的增加或杀伤细胞凝集素样受体（KLRG1）的表达常被用作T细胞免疫衰老标记物。
在接受PD－1／PD－L1抑制剂治疗的非小细胞肺癌患者中，衰老T细胞增加与不良预后相关。CD8 T细胞中衰老T细胞的临界值为39．5％，可预测PD－1／PD－L1阻断的临床疗效（敏感性100％，特异性35％）。具有免疫衰老表型的循环T细胞可能是ICI治疗结果的潜在预测性生物标志物。
记忆T细胞
T细胞识别抗原后经历自然分化，并根据以下表面标记物进行表型细分：幼稚T细胞（TN，CD45 RO－CCR7＋），中心记忆T细胞（TCM，CD45 RO＋CCR7＋），效应器记忆T细胞（TEM，CD45 RO＋CCR7?）， 和终末效应T细胞（TTE，CD45RO－ CCR7－） 。处于每个分化阶段的T细胞在ICI诱导的抗肿瘤免疫中具有独特的作用，并显示出作为ICI治疗结果预测性生物标记物的各种潜力。
一些研究已经报道了TCM细胞在ICI治疗反应中的预测潜力。循环CD4＋TCM细胞似乎与接受抗PD－1抑制剂的NSCLC和RCC患者的良好反应和更好的预后相关。其他研究揭示了TEM细胞在预测ICIs临床益处方面的潜在作用。在使用PD－1抑制剂治疗的黑色素瘤患者中，观察到应答者的循环CD8＋TEM细胞频率较高，CD4＋TEM细胞和幼稚CD8＋T细胞频率较低。在使用抗CTLA－4抗体ipilimumab治疗的黑色素瘤患者中也报告了一致的结果。
总的来说，在预测ICIs反应时，可以考虑外周血特定分化阶段的记忆T细胞。
PD－1＋CD8＋T细胞的TCR克隆性和多样性
一些研究人员关注TCR克隆性在循环T细胞中作为ICI反应的预测决定因素的作用。在非小细胞肺癌中，不仅在肿瘤组织内，而且在循环T细胞中观察到显性TCR扩增， ICI应答者血液中出现早期和持续的TCR克隆扩增。
此外，TCR多样性是PFS和OS的独立预后因素。PD－1＋CD8＋T细胞较高的TCR多样性可能反映出新抗原识别的较高概率。ICI给药后，肿瘤特异性T细胞的显性克隆扩增显示出良好的临床反应。
监测TCR系统有助于预测ICI的益处。然而，ICI治疗后外周血中TCR克隆的扩增可能不能完全反映肿瘤内TCR库的真实多样性，也可能不足以抑制肿瘤生长。研究表明，ICI治疗的肿瘤反应不仅需要TCR基因库的克隆扩展，还需要肿瘤获得足够的TCR。因此，治疗后TCR克隆在血液和肿瘤中的扩增对于ICIs的治疗反应至关重要。
CD4＋T细胞
CD4 T细胞可以通过支持CD8＋T细胞的启动、迁移和存活来促进抗肿瘤免疫。此外，功能性CD4＋T细胞对于在抗PD－1／PD－L1治疗后恢复CD8＋T细胞的细胞毒性是必要的。在接受PD－1／PD－L1抑制剂治疗的NSCLC患者中，外周血基线较高的高分化CD4＋T细胞（CD27－ CD28low／negative）比例（＞40％）可预测客观RR，具有100％的特异性和70％的敏感性。
最近的一份报告显示，CD62 LlowCD4＋T细胞与NSCLC患者对nivolumab的临床反应相关。与无应答者相比，nivolumab应答者在基线时的CD62 LlowCD4＋T细胞循环水平更高（p＜0．001）。
总之，CD4＋T细胞免疫的内在功能可能是恢复抗肿瘤免疫和预测ICIs治疗患者预后的关键因素。
免疫抑制细胞：MDSCs和Treg
MDSCs是一组异质性的髓系细胞，不能分化为粒细胞、巨噬细胞或树突状细胞。它们通过抑制T细胞和NK细胞、刺激Treg显示免疫抑制活性，并在各种恶性肿瘤中发挥重要作用。
MDSCs分为两种表型：粒细胞性MDSC（G－MDSCs）和单核细胞样MDSC（M－MDSCs）。一项研究检测了接受ipilimumab治疗的黑色素瘤患者循环中的M－MDSCs。与健康志愿者相比，黑色素瘤患者在基线检查时的M－MDSCs发生率更高。
由于MDSCs与中性粒细胞具有共同的特征，因此很难明确区分。最近，凝集素型氧化低密度脂蛋白受体－1（LOX－1）被认为是癌症患者的MDSCs特异性标记物。最近的一项研究检测了nivolumab治疗的非小细胞肺癌患者中表达LOX－1的MDSCs和Treg。在探索性队列中，外周血中LOX－1＋PMN－MDSCs的基线水平在应答者和非应答者之间没有差异，而应答者的Treg水平高于非应答者。有趣的是，nivolumab治疗后应答者中LOX－1＋PMN－MDSCs的水平显著降低，但在LOX－1＋PMN－MDSCs和Tregs之间存在负相关。因此，PD－1抑制期间Tregs和PMN－MDSC的相对变化有助于预测ICI治疗的良好反应和更好的预后。
此外，关于Treg，结果存在争议。一些研究显示正相关，而另一项研究报告了负相关，其他研究报告Treg与ICI结果之间没有关系。因此，Treg的临床意义需要进一步研究。
自然杀伤细胞
在ICI治疗期间，NK细胞在没有抗原致敏的情况下诱导适应性免疫反应。有研究表明，与无反应组相比，受益于nivolumab治疗的NSCLC患者组的CD56＋NK细胞具有更高的细胞毒性表型。在本研究中，循环NK细胞的高基线水平与OS延长相关。然而由于样本量小，需要进一步验证。
细胞因子和可溶性蛋白
细胞因子是释放到体循环中的免疫信号蛋白，主要在局部细胞水平发挥作用。各种报告已证明使用可溶性因子，如IL－6、IL－8、可溶性CTLA－4（sCTLA－4）、可溶性PD－1（sPD－1）、可溶性PD－L1（sPD－L1）、CRP和LDH，作为免疫治疗反应的预测或预后因子。这些细胞因子和可溶性检查点分子可以很容易地使用ELISA进行测量，从而有助于对多个外周血样本进行自动化、高灵敏度和准确的分析。
IL－6
IL－6由多种细胞分泌，包括免疫细胞和肿瘤细胞。它通过抑制癌细胞凋亡和促进肿瘤血管生成来促进肿瘤进展。在之前的一项研究中，接受IL－2免疫治疗的晚期黑色素瘤患者血清IL－6水平越高，OS越短。另一方面，抗PD－1／PD－L1治疗后IL－6水平降低与非小细胞肺癌患者的PFS改善相关，并与CRP水平变化相关。
IL－8
IL－8是CXC趋化因子家族的成员，对中性粒细胞趋化性非常重要。在多种肿瘤类型中，IL－8由肿瘤细胞和肿瘤基质细胞分泌。
Sanmamed等人报告，接受抗PD－1治疗的黑色素瘤和NSCLC患者在治疗早期血清IL－8水平降低与更长的OS相关。此外，他们还表明血清IL－8水平与肿瘤IL－8的产生相关。此外，血清IL－8水平可以正确区分放射学假进展和真实疾病进展。
另一项研究中证明了IL－8在1445例尿路上皮癌（UC）和肾细胞癌患者中的预测作用。在这项研究中，血浆IL－8的高基线水平与atezolizumab治疗UC和RCC的疗效降低和不良预后显著相关。
IL－10
IL－10在癌症免疫中起着多样性作用。它通常被认为是一种促进肿瘤生长的免疫抑制因子，而最近的研究表明，外源性IL－10给药可通过促进CD8＋T细胞介导的抗肿瘤免疫而诱导抗肿瘤效应。在实体恶性肿瘤和血液恶性肿瘤中，高水平血清IL－10与较差的生存结果相关。
可溶性CTLA－4（sCTLA－4）
最近的研究试图阐明可溶性检查点分子在免疫调节中的作用。sCTLA－4主要由Treg分泌，sCTLA－4可以在正常人血清中检测到，但在许多癌症类型中其水平升高。
Pistill等人证明，与血清sCTLA－4水平较低的黑色素瘤患者相比，基线时血清sCTLA－4水平较高（＞200 pg／mL）的黑色素瘤患者经ipilimumab治疗后具有更好的ORR和OS，表明血清sCTLA－4可作为预测对ipilimumab反应的生物标记物。有趣的是，较高的基线sCTLA－4水平与更频繁的免疫相关不良事件发生相关，尤其是在胃肠道。
可溶性PD－1（sPD－1）或PD－L1（sPD－L1）
肿瘤细胞和成熟DC产生并释放sPD－L1。然而，sPD－L1作为预测性生物标记物的潜在用途仍有待确定。Ugurel等人报道，黑色素瘤患者的sPD－1和PD－L1水平高于健康对照组。他们发现，在转移性黑色素瘤患者中，基线水平升高的sPD－1和sPD－L1水平与PD－1阻断的不良反应相关。此外，与sPD－1和／或sPD－L1水平较高的患者相比，基线时水平较低的患者的PFS和OS更长。同样，其他研究也表明，sPD－1或sPD－L1的基线水平较高与黑色素瘤ICI治疗的不良临床结果相关。
CRP
CRP是由肝细胞产生的血清炎症蛋白。其血清水平在大多数炎症反应中迅速升高，据报道，CRP水平升高与癌症风险增加相关。有研究表明，在使用PD－1抑制剂治疗的癌症患者中，基线时的高CRP水平与不良的PFS和OS相关。另一方面，最近的一项研究表明，CRP flare反应（CRP在治疗早期迅速升高，然后在治疗后不久下降）与使用nivolumab治疗的RCC患者的更好临床结果相关。
乳酸脱氢酶
基线血清LDH水平通常被认为是晚期黑色素瘤患者接受ipilimumab或pembrolizumab治疗后OS缩短的独立预测因素。一些研究表明，在接受免疫治疗的各种恶性肿瘤患者中，高基线血清LDH水平与较差的抗肿瘤反应相关。
循环肿瘤细胞和肿瘤细胞衍生因子
循环肿瘤细胞（CTC）
CTC是从肿瘤组织中分离出来并在血液中自由循环的癌细胞。由于CTC与整体肿瘤负担、肿瘤侵袭性和血行转移的可能性密切相关，CTC的存在是各种癌症类型中一个独立的不良预后因素。因此，使用液体活检进行CTC测量用于癌症诊断、分子分析和治疗反应监测。
Tamminga等人报道，在基线检查时或ICI治疗开始后4－6周，三分之一的晚期NSCLC患者中检测到CTC。他们还表明，有CTC的NSCLC患者的PFS和OS比没有CTC的患者更差。有趣的是，大约50％的NSCLC患者在两个时间点都没有CTC，或者在ICI治疗期间CTC减少，显示出持久的治疗反应。因此，分析CTC的频率和动力学，特别是在没有可用肿瘤组织的NSCLC患者中，可以帮助预测ICI治疗的早期反应。
ctDNA
DNA可以从凋亡或坏死的肿瘤细胞释放到体循环中。这种肿瘤来源的循环DNA，ctDNA，半衰期短，可作为实时生物标记物用于监测ICI治疗后的免疫反应。
在使用抗PD－1抗体durvalumab治疗的NSCLC和UC患者的回顾性研究中，ctDNA变异等位基因频率（VAF）的变化与临床结果相关，治疗开始后6周ctDNA VAF的早期降低与更长的PFS和OS相关。
另一项研究还显示，在接受一线pembrolizumab±化疗的晚期非小细胞肺癌患者中，基线检查和首次治疗取样之间ctDNA等位基因频率的降低与较高的RR、较长的PFS（8．3 vs 3．4个月，p＝0．0007）和较长的OS（26．2 vs 13．2个月，p＝0．008）相关。总之，ICIs治疗患者的早期ctDNA变化可作为一种潜在的生物标记物，用于捕捉早期免疫反应和生存结果。
血液TMB
TMB是肿瘤新抗原增加的替代标记物，因此用于预测抗PD－1／PD－L1治疗的临床益处。Wang等人报道，使用癌症基因组NCC－GP150估算的血液TMB（bTMB）与使用全外显子组测序计算的组织TMB高度相关。在接受抗PD或抗PD－L1抗体治疗的NSCLC患者中，bTMB≥ 6与较高的应答率（39．3％ vs 9．1％，p＝0．02）和较高的PFS（HR 0．39，p＝0．01）相关。
因此，bTMB是预测非小细胞肺癌患者临床预后的一个可行的生物标志物，有必要确认它是否也适用于非小细胞肺癌以外的其他适应症。
外泌体
外泌体是从各种细胞释放的细胞外小泡，含有蛋白质和核酸等生物活性物质。最近，研究表明PD－L1可以通过外泌体从肿瘤细胞传递到其他细胞。因此，外泌体可对抗肿瘤免疫反应产生负面影响。
一项研究显示了外泌体在晚期黑色素瘤患者中的预测作用。在肿瘤源性外泌体上PD－1和CD28基线表达较高的患者与表达较低的患者相比，PFS和OS更长。此外，治疗前后DC衍生外泌体上CD80和CD86分子的增加与ipilimumab的临床疗效相关。
总的来说，循环外泌体在抗肿瘤免疫反应中可作为重要的免疫调节因子，并具有作为ICI治疗预测性生物标记物的潜在价值。
小结
外周血生物标志物在免疫肿瘤学领域迅速出现。它们不仅反映了肿瘤生物学，还提供了关于不断变化的宿主对肿瘤免疫反应的深入信息。许多转化研究已经证明了ICI治疗期间各种血液生物标志物的预后或预测价值。这些结果使我们能够更好地理解ICI治疗过程中癌细胞与宿主免疫系统之间复杂而动态的相互作用，并且至少在一定程度上有助于区分将对ICI治疗产生积极反应的患者与不会产生积极反应的患者。
由于不同的癌症可能在TME内具有不同的免疫抑制细胞和细胞因子，并且不同的ICI可能具有不同的免疫作用机制，因此生物标记物的特异性可能因癌症类型和ICI而异。因此，ICIs的生物标记物开发和优化应针对每种癌症类型和药物的免疫学特征而定。此外，由于外周血分析采用了各种复合分析法，因此这些分析方案及其报告方法需要标准化，还需要对每种分析法的采样时间点、敏感性和特异性进行额外的研究，以确保其临床适用性。
参考文献：
1．Peripheral Blood－BasedBiomarkers for Immune Checkpoint Inhibitors． Int J Mol Sci． 2021 Sep；22（17）： 9414．
