2．TIL、淋系和髓系评分相关的免疫细胞
MCP－counter是一种通过量化RNA测序结果来评估肿瘤中8个主要免疫细胞和2个基质细胞群体丰度的方法。对上述细胞对应的10个变量与TIL、淋系和髓系评分的相关分析发现：除中性粒细胞以外，MCP－counter包含的所有免疫相关变量与TIL评分、淋系评分和髓系评分之间都有很强的相关性，而成纤维细胞和内皮细胞与上述三种评分之间则未发现相关（图2A）。
接下来，进一步评估了TIL评分对淋系和髓系细胞在瘤床中丰度的代表能力。具体方式是运用LASSO模型从MCP－counter的10个变量中选择最佳的能够预测TIL评分的变量。结果显示在各种癌症类型中，平均需要7个（范围为5－10，图2B）MCP－counter的变量来预测TIL，提示TIL能较好地描述肿瘤免疫的情况。为了进一步深入探究，又用上述LASSO模型探究了不同癌症类型中预测淋系和髓系评分所使用的MCP－counter中的变量情况（图2C，D）。
在上述结果中，可以发现，在大多数癌症类型中，预测TIL评分最重要的两个变量是T淋巴细胞和单核细胞，而对于淋系评分的预测，最重要的变量是T细胞和B细胞，还有重要性稍低的NK细胞和细胞毒性淋巴细胞；对于髓系评分则是单核细胞，这一发现表明TIL评分可以较好地代表TCGA泛癌队列中T淋巴细胞和单核细胞丰度，而淋系评分可以代表T细胞、B细胞以及较低程度上代表NK细胞丰度，髓系评分则是单核细胞丰度的良好指标。
图2A．TIL、淋系和髓系评分与MCP－counter中10个变量的相关分析；图2B，C，D．使用LASSO模型基于MCP－counter预测TIL、淋系和髓系评分时使用的变量情况
3．TIL signature在泛癌TCGA队列中的预后评估
接下来，对TIL评分以及淋系和髓系评分在TCGA泛癌队列中预测预后的能力进行评估，将它们与两个作为黑色素瘤免疫检查点阻断疗效预测的signature——IMPRES和IPS进行了比较。IMPRES包括15对免疫检查点基因，IPS则是效应细胞，抑制细胞，主要组织相容性复合体（MHC）相关分子，检查点／免疫调制剂四个评分的总和。将TIL、淋系和髓系评分视为连续变量，通过单变量Cox模型评估了这些变量预测总生存期（OS）和无进展间隔（PFI）的能力（图3A，B）。以对OS的预测作为参考基准，TIL、淋系和髓系评分与IPS和IMPRES评分对预后的预测能力以及预测结果都较为相似，但前三种评分对头颈部鳞状细胞癌以及微卫星不稳定状态的结肠癌具有显著的更好的预测性能。以对PFI的预测作为参考基准分析也观察到了类似的结果。上述结果表明TIL，淋系和髓系三种评分可以提供与IMPRES和IPS相同以及互补的预后信息。
下一步，将TIL，淋系和髓系评分与IMPRES和IPS预测OS和PFI的时间依赖性ROC曲线的AUC进行了比较，发现TIL、淋系和髓系评分的AUC非常接近，但在预测9种癌症的OS以及10种癌症的PFI时，它们的表现优于IMPRES和IPS（图3C，D）。为进一步探讨TIL对肿瘤预后预测的贡献，首先构建包含年龄、性别、肿瘤类型和肿瘤分期的Cox模型，随后又将基于基因signature的TIL评分和基于HE染色评估的TIL评分添加到模型中。以OS作为比较基准，发现基于基因signature的TIL评分在9种癌症类型中提高了预后预测的准确性，而基于HE染色的TIL评分没有提高模型的精度。在类似的分析中，可发现淋系评分在6种癌症类型中提高了预后预测的准确性，而基于HE染色的TIL评分依然没有类似效果。这些数据共同说明TIL评分是TCGA泛癌队列中与OS和PFI相关的一个强有力的预后预测指标，而且提示免疫肿瘤微环境的整体评估对患者的预后预测有重要作用。
图3A，B．TIL、淋系和髓系评分以及IMPRES和IPS在不同癌症类型中与患者预后的关联；图3C，D．TIL、淋系和髓系评分以及IMPRES和IPS预测不同癌症类型患者预后的性能对比
4．用于预测对抗PD－1／PD－L1或CTLA－4反应的TIL评分的评价
随后，对TIL、淋系和髓系评分是否可以作为多个癌症类型的PD－1／PD－L1抑制剂疗效的生物标志物进行探究。为此参考了Yarchoan等人的meta分析——文章中总结了在几个已发表的临床试验中单独使用PD－1／PD－L1抑制剂的客观缓解率（ORR）。依据这些数据，评估了多个癌症类型中TIL、淋系和髓系评分的中位数与PD－1／PD－L1抑制剂使用后ORR之间的相关性（图4A－C），观察到TIL和淋系评分都与PD－1／PD－L1抑制剂使用后ORR有关，淋系评分的相关系数略高于TIL评分；但髓系评分并未观察到类似的相关。另外，还对经典的生物标志物肿瘤突变负荷（TMB）、扩展免疫signature（EIG）和PD－L1（CD274）表达进行了类似的分析，与预期一致，所有这些变量都与PD－1／PD－L1抑制剂使用后ORR显著相关。评估了TMB、EIG、PD－L1表达和淋系评分四者之间的相关情况，发现TMB与EIG，TMB与淋系评分之间都没有关系，但EIG、PD－L1和淋系评分三者之间存在密切相关（图4D）。
图4A，B，C．不同癌症类型的TIL、淋系和髓系评分与应用抗PD－1／PD－L1疗法后ORR的关联；图4D．TMB，ORR，CD274表达，淋系评分和EIG的相关分析
随后进行了包括TMB、EIG、PD－L1表达和淋系评分这几个变量的多因素线性回归，以得到预测ORR的最佳模型（表1）。使用AIC（一个反映统计模型拟合优良性的指标）作为参考，建立了TMB＋淋系评分的最佳模型。用ANOVA对单独使用TMB和使用TMB＋淋系评分的模型进行比较，发现淋系评分显著改善了模型的预测性能（p＝0．05）。上述结果提示：单独使用淋系评分或者淋系评分＋PD－L1表达／TMB的模型有潜力作为简单而普适的预测免疫检查点抑制剂的疗效的方法。
表1．包含TMB、EIG、PDL1（CD274）表达和淋系评分的多因素线性回归结果
