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题目:激活WNT可作为髓母细胞瘤的治疗策略
一、研究背景
MB是最常见的儿童恶性脑肿瘤, 分为四个分子亚组(Wnt,Shh,第3组,第4组)。
在临床上,Wnt MBs的预后较好,而非Wnt MB易转移、复发率高、预后差。
已有报道证明Wnt激活在Shh驱动的MB中存在抗肿瘤作用。
二、研究流程
1、检测MB中不同亚型之间的差异
2、探究Wnt与自我更新能力的关系
3、探究Wnt活性与致瘤潜力的关系
4、探讨wnt通路的激活对肿瘤的影响
三、结果分析
1、MB BTIC保留小组隶属关系
作者对大规模的MB数据进行差异表达分析,并使用单样本基因富集分析(ssGSEA)对上调的基因进行评分,发现其分别在Wnt,第3组和第4组MB样品中显示出最强的正富集(补充图 1b)。因此,MB BTIC系之间存在子组隶属关系。
通过对非Wnt MB(第3组和第4组)的基因集富集分析(GSEA)与主成分分析(PCA),作者发现,Bmi1基因表达活跃。而在Wnt MB系中,细胞周期检查点和凋亡基因标记更为活跃。
使用体外和体内致瘤实验,通过TCF报告基因检测,作者发现,与第3组和第4 组MB系相比,Wnt中内源性Wnt活性显著增加。
2、MB BTICs中的异位Wnt激活损害肿瘤发生
作者在Wnt3A条件培养基培养SU_MB002细胞,评估第3组MBS中 Wnt/β-catenin通路的完整性,发现Axin2基因(Wnt下游靶基因)表达显著增加,继发性肿瘤球的体积减小、发生频率降低,即Wnt激活后侵袭性MB的致癌表型发生改变。
Bmi1和Sox2基因对细胞自我更新能力至关重要,与患者存活显著关联。对基因表达量高低、年龄,转移状态和亚组与Bmi1和Sox2基因进行单因素和多因素生存分析(图1a),发现Sox2基因表达量高低与患者生存率显著相关。在Western plot 中,与Shh(Daoy),第3组(SU_MB002,HD-MB03,RCMB40,D425,Med8A,D458)和第4组(ICB1299)相比,Wnt MB BTIC(BT853)中自我更新基因Bmi1和Sox2的表达均降低(图 1b),表明跨MB亚组的自我更新活动存在差异。
编码β-catenin的CTNNB1在86%的Wnt MB中发生了突变,AXIN2是重要的Wnt/β-catenin信号通路的调控因子,于是用Axin2的表达来确定第3组中β-catenin突变体的过表达,随之发现Bmi1和Sox2表达量减少(图1c、d),而且与对照组相比,过表达β-catenin的细胞系的自我更新能力也显著降低(图1e)。
因此,说明抑制自我更新途径可以解释Wnt MB的转归改善。
图1:MB BTICs中的异位Wnt激活损害肿瘤发生
3、非Wnt MB含有致瘤性较低的Wnt活性细胞
作者通过检测不同亚组的GSVA富集得分(图2a),对Group 3和Group 4 MB中Wnt亚组中的Wnt活性进行判断。作者让细胞分类着色以此来丰富Wnt亚组的标记(图2b),暗红色细胞表示超过了5%的临界值,并被认为显着富集了基因标记,而灰细胞则表示未通过阈值。接着,作者进一步采用箱型图表示每个样本中的Wnt亚组标记的得分(图2c),以及在叠加条形图中用暗红色区域来表示说明每个样品中富含Wnt亚组基因特征的细胞比例(图2d)。
因此,作者说明非Wnt MB中也含有致瘤性较低的Wnt活性细胞,并在scRNA-SEQ的四个独立的数据集和大块肿瘤RNA-SEQ数据得到验证。
图2:非Wnt MB含有致瘤性较低的Wnt活性细胞
接下来,作者想要探究Wnt活性与Wnt MB中致瘤潜力的关系。于是使用慢病毒Wnt报告基因(7XTCF-GFP),从第3组MB细胞中鉴定出Wnt活性细胞(TGP +),并用流式细胞仪分离出Wnt活性(TGP +)和Wnt惰性(TGP-)细胞。然后,作者使用基于TCF的荧光素酶报告基因分析法验证了TGP +细胞中的Wnt活性(图 3a)和Axin2转录水平(图 3b),发现与TGP-细胞相比,TGP +细胞中Bmi1和Sox2的表达水平更低。
对小鼠颅内注射稀释后的SU_MB002 TGP +与TGP-细胞。与注射TGP-相比,TGP +异种移植物减少了肿瘤负荷(图3e)并提高了存活率(图3f)。通过对这些异种移植物中的GFP(异种移植物免疫组化染色的一抗)阳性进行免疫染色,观察到部分TGP +细胞转变为TGP-细胞(图3g)。
Wnt标记高表达的难治性MB患者(Wnt high)与Wnt标记低表达(Wnt low)的患者相比,总体生存率有所改善 (图3h), 这似乎预示着Wnt标记高表达MBs存活率会提高。
因此说明,随着难治性MBs的内源性Wnt活性提高,MB细胞的致瘤特性会降低。
图3:探究Wnt活性与Wnt MB中致瘤潜力的关系
4、MB异种移植物的药理学Wnt活化可提高生存率
GSK-3通过磷酸化下游Wnt效应子β-catenin,使其失去功能,从而抑制Wnt /β-catenin信号传导。小分子CHIR99021为GSK-3的竞争性抑制剂,可竞争结合ATP;而L807mts是GSK-3的底物竞争性肽抑制剂。
细胞经L807mts处理后,TCF报告基因实验与GSEA富集分析检测到Wnt激活,PCA分析检测到转录机制发生变化(图 4a),且RNA-seq数据也显示出不同的基因表达谱(图 4b);另外,GSEA发现L807mts处理的样品中凋亡和G2M检查点相关基因标记的表达增加(图4c),而且,在体外(图4d)和体内(补充图24)用L807mts治疗后观察到放射增敏作用的增加,同时,Bmi1和Sox2水平也降低了(图4e、4f)。
图4:MB异种移植物的药理学Wnt活化
给植入SU_MB002细胞或RCMB40细胞的小鼠,每隔一天以50μg/剂量进行L807mts治疗,发现,总体肿瘤负荷减少(图 5a–c,补充图 25a-b)和总体生存率提高(图 5d,5e)。这些临床研究说明了高度特异性小分子Wnt激动剂具有治疗MB的潜在临床效用。
图5:L807mts治疗后,总体肿瘤负荷与总体生存率的变化
小结
MB分为四个亚组,在临床上,Wnt MBs的预后较好,而非Wnt MB易转移、复发率高、预后差。本文通过检测不同亚组的基因表达,发现Wnt活性高低存在差异,而Bmi1和Sox2基因的表达可反映肿瘤的自我更新能力。作者增加wnt表达, 发现细胞自我更新能力下降,肿瘤进展放缓;接着进一步从体内验证Wnt活性降低了致瘤潜力。最后,在机制上通过L807mts抑制GSK-3,进一步验证了激活Wnt /β-catenin途径可抑制肿瘤进展,说明激活Wnt信号传导可作为潜在靶向第3组和第4组MB的治疗策略
